南开大学《ACS Nano》：芦丁纳米颗粒光抑制剂助力高效光基生物3D打印
时间:2024-08-20 16:10 来源:EFL生物3D打印与生物制造 作者:admin 点击:次
数字光处理（DLP）3D打印技术以其高分辨率和高打印速度而备受关注，其通过精密的逐层投影进行打印，能够实现生物材料在空间上的的精准排列，现已成为组织工程和再生医学中不可或缺的重要工具。然而，对于基于光基聚合的打印方式，高保真度取决于对光-材料相互作用的精确控制。在DLP打印过程中，固有的光线散射以及不精确的固化深度控制使得自由基反应在设计区域外发生，这些多余的聚合反应会造成打印模型的扭曲和失真，极大地影响了制造结构的保真度。为了减轻非预期聚合带来的不良影响，在之前的研究中往往通过添加光吸收剂来在空间上限制光线的分布，将光线最大程度地集中在单层的设计区域中，以提高打印精度。然而，这种基于光吸收的策略极大地耗散了激发光中的能量，导致打印速度下降；同时也难以在充满细胞的环境下发挥功能。追根溯源，一种更为全面、高效的策略不仅需要通过光吸收限制光的分布，更应该通过与自由基反应，将自由基反应严格地限制在设计区域内，进一步提升加工精度。同时，还需要考虑打印速度的提升以及适宜的细胞相容性，以期实现一种高精度、快速度和细胞亲和的高效生物制造模式（图1）。
鉴于此，南开大学孔德领教授、博士后董显豪联合天津市第一中心医院范猛主任在《ACS NANO》上发表题为“Efficient Light-Based Bioprinting via Rutin Nanoparticle Photoinhibitor for Advanced Biomedical Applications”的研究论文。利用天然黄酮类化合物中最廉价易得的芦丁，通过在温和、绿色的水溶液环境中简单的一步自组装方法，开发了一种新型水溶性光抑制添加剂——芦丁纳米颗粒（Rnps）。Rnps能够同时进行光吸收过程和自由基反应，因此能够抑制散射效应，提升打印精度。 
图1 Rnps的制备过程及其在光基生物打印中作为光抑制剂的特性示意图
作者通过将芦丁粉末溶解在NaOH溶液中，此时芦丁以芦丁钠盐的形式存在（NaR），随后通过调节pH使芦丁和NaR发生分子间自组装形成Rnps。光吸收剂柠檬黄（Tar）由于其良好的生物相容性，被广泛用于各种生物制造中。因此，作者选择Tar作为对照，比较了Rnps和Tar对405nm打印波长光线的吸收能力，并检测了不同浓度Rnps的自由基清除能力。结果表明，Rnps对405nm光线的吸收能力与Tar不相上下，且在水中表现出良好的ABTS自由基清除能力，有利于其在光—自由基打印中发挥有效功能（图2）。 
图2 Rnps的合成与表征
为了验证Rnps在生物墨水中发挥的具体作用，作者以5% GelMA（EFL-GM）为例，测试了具有不同浓度Rnps的生物墨水的具体性质，包括流变特性、力学性能、稳定性、打印速率等。使用EFL品牌的DLP生物3D打印机（EFL-BP8601 Pro）对打印，以便开展后续测试。实验结果证明，Rnps的加入并不会影响打印支架的机械性能。相较于只进行光吸收的Tar，Rnps的加入能够改善打印的层间均质性，同时也抑制了打印过程中，由多余自由基反应导致的墨水粘度提升。此外，加入0.1%Rnps的生物墨水展现出更快的制备速度，这有利于其在生物打印中的应用（图3）。 
图3 光敏生物墨水配方和打印性能的优化
为了证明Rnps在提高打印分辨率和图案保真度方面的能力，作者通过打印辐条状图案来评估打印的横向分辨率。随着Rnps浓度的增加，观察到保真度提高，且0.1% Rnps组获得的最佳可打印分辨率显著超过0.1% Tar组。打印精度的提高归因于Rnps同时进行的光吸收和自由基清除过程，说明该策略有效提高了打印精度和图案细节的保真度。接下来，作者研究了Rnps在多层竖直孔道结构制造中的作用。在打印直径为2mm和1mm通道时，0.1% Rnps组与0.1% Tar组相比，过固化和通道堵塞显著减少，这与Rnps在打印过程中抑制墨水粘度上升有关。结果分析表明，Rnps在打印更精细的孔道结构时比传统光吸收剂更具优势（图4）。 
图4 通过富含Rnps的生物墨水提高打印分辨率和结构保真度
在生物打印中，生物墨水的细胞相容性对于维持细胞的存活和增殖至关重要。作者使用人诱导多能干细胞衍生的内皮细胞（hiPSC-ECs）进行细胞种植和载细胞打印。基于打印精度、速度和细胞兼容性进行筛选，最后选择含有 0.1% Rnps 的生物墨水用于后续实验。芦丁已被证实具备多种有益的生物活性，包括抗炎特性、线粒体代谢调控，以及显著的抗凋亡能力。作者为了验证Rnps是否保留了抗氧化调节能力，在细胞经Tar或Rnps处理后，使用H2O2对其进行氧化刺激，随后分别测量胞内ROS、超氧化物的浓度以及线粒体膜电位水平。作者还通过qPCR验证了抗氧化/抗凋亡相关基因表达的变化情况。结果证实了Rnps在胞内不仅参与自由基清除，同时也介导细胞修复和凋亡抵抗力增强，赋予细胞抵抗氧化应激和避免凋亡的卓越能力（图5）。 
图5 通过添加Rnps提高生物墨水的细胞兼容性、打印保真度和抗氧化性
Rnps在复杂结构制造和多材料打印中也展现了良好的性能。作者采用含有Rnps的生物墨水，成功地制作具有TPMS结构的复杂支架，所得结构特征薄壁的厚度在50到150μm之间，在细节上显示出高分辨率。同时，由于Rnps对于多种生物墨水的良好兼容性，使其能够在多材料制备中发挥作用，以实现多种材料在空间上的精确分布，比如金字塔模型所示的连续梯度材料的制备，以及如魔方模型所示的多材料一体化打印。EFL研发的多材料DLP生物打印机（EFL-BP8601 Mix）为具有结构复杂性的多材料模型制备提供了平台。在气管状模型、肝小叶、手掌模型等器官结构的仿生构建中，作者利用基于Rnps的多材料打印，模拟了这些器官在结构上的复杂性。为了体现该打印方式在药物精确负载中的应用，作者设计并构建了具有“NKU”内嵌复杂结构的药片以及一个多药物集成负载的药片模型，以展现其载药的便利性以及高通量。此外，作者还通过打印不同种类的载细胞空心分叉管结构，展示了基于Rnps的载细胞打印在可灌注血管样组织制备中的应用。这些结构的成功制备，进一步说明了基于Rnps的打印方法在多种生物医学场景下的应用潜力（图6）。 
图6 Rnps在复杂结构制造和多材料打印中的性能
全文总结 本研究中开发了一种简单而普适的芦丁基光抑制剂——Rnps，其通过同时进行光吸收过程和自由基反应，能够有效地减弱DLP 3D打印中光散射的影响，提升打印保真度。与Tar相比，含有Rnps的生物墨水打印速度提升至1.9倍，层间过曝减少58%，分辨率提高38.3%，高精度打印区间扩大至3倍。使用这种光抑制剂制备的支架具有出色的细胞相容性以及出色的抗氧化活性。Rnps能够适用于各种生物墨水，是创建多材料和多功能生物医学结构的理想工具。将Rnps集成到其他生物制造平台中可能会为组织和器官的复杂体外重建提供更多技术支持，从而加速其从理论模型到临床转化的发展进程。 南开大学生命科学学院孔德领课题组硕士生李飞逸，本科生李馨月，博士生代殊昕为本文共同第一作者。该研究工作得到国家自然科学基金创新研究群体项目和青年项目，以及博士后基金面上项目与物质绿色创造与制造海河实验室等项目的支持。在这项研究中，应用了EFL品牌的投影式光固化生物3D打印机（EFL-BP8601 Pro、EFL-BP8601 Mix），和EFL品牌的多种光固化生物材料（EFL-GM、EFL-F127DA、EFL-HAMA等）进行实验，感谢EFL对研究工作的鼎力支持。 文章来源： https://doi.org/10.1021/acsnano.4c05380 (责任编辑：admin) |